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Soutenance de thèse: Kyriakos Sklias

Titre:

Etude de microjets de plasma comme sources d'espèces réactives pour des applications biomédicales

mercredi 30 mars 2022 à 14h30, amphi I, 2ème ét., bat 210, LPGP, UPSaclay, Orsay (comment venir)

Résumé:

Dans ce travail, trois différents réacteurs à plasma froid à pression atmosphérique ont été étudiés comme sources d'espèces réactives d'oxygène et d'azote pour des applications biomédicales. Plus précisément, les réacteurs utilisés étaient un jet de plasma, un multi-jet de plasma et une micro-cathode sustained discharge. Ce travail est divisé en trois parties. La première partie concerne l'étude de la phase gazeuse des plasmas et son objectif principal est de fournir des informations sur les propriétés physiques et chimiques des plasmas produits. Tout d'abord, le champ électrique localisé à l'avant de l'onde d'ionisation a été mesuré par spectroscopie d'émission optique, en se basant sur la séparation et le déplacement de Stark dépendant de la polarisation de différentes raies de l’He et de leurs composants interdits. Deuxièmement, pour déterminer la densité électronique, l’élargissement de Stark de différentes raies d'hydrogène a été utilisé. Enfin, la température du gaz du plasma a été estimée à l'aide des distributions rotationnelles de molécules sondes sélectionnées de manière appropriée (OH et N2 à 309 et 316 nm, respectivement). Nous avons constaté que le champ électrique sur le front de l'onde d'ionisation augmente lorsque le plasma s'approche du liquide traité. En conséquence, la température du gaz ainsi que la densité électronique du plasma sont également plus importantes plus près du liquide. La deuxième partie de ce travail est une étude de la composition chimique du PBS traité au plasma (pPBS). Ainsi, la production de H2O2, NO2–, NO3–, •OH, O2(a1Δg), O3, HCl– et ONOO– a été étudiée dans le pPBS, en effectuant de la colorimétrie en phase liquide couplée à de la spectroscopie d'absorption et de fluorescence. Parallèlement, le pH et la conductivité du pPBS ont également été mesurés. De plus, la capacité à conserver les espèces réactives à longue durée de vie (H2O2, NO2– et NO3–) sur une longue période a été étudiée en fonction du temps et de la température de stockage du pPBS. Il est montré dans ce travail que si le pPBS est stocké dans des conditions pertinentes, la concentration de ces espèces réactives à longue durée de vie, et donc la capacité anticancéreuse du pPBS, reste stable pendant plus de 75 jours. Sachant que ces espèces réactives de l'oxygène et de l'azote à longue durée de vie sont les principaux moteurs de la capacité anticancéreuse du traitement par plasma en oncologie, la troisième partie de ce travail, réalisée en étroite collaboration avec des biologistes, concerne l'application du plasma sur des cibles biologiques et l’évaluation de la contribution de ces espèces réactives à sa cytotoxicité. Ainsi, en utilisant deux modèles de cellules cancéreuses de la tête et du cou (CAL27 et FaDu) et trois lignées cellulaires normales (fibroblastes humains primaires, kératinocytes gingivaux primaires et cellules épithéliales), la capacité anti-tumorale des traitements directs et indirects au plasma a été évaluée selon l’activité métabolique cellulaire, la viabilité cellulaire, la peroxydation lipidique, la production de ROS intracellulaires et l’induction de la caspase 3/7. Nous avons constaté que la sélectivité du traitement au plasma pour tuer les cellules cancéreuses au lieu des cellules normales dépend fortement des espèces réactives à courte, moyenne et longue durée de vie présentes dans le pPBS. Plus précisément, lorsque les cellules sont traitées directement avec le plasma, nous avons observé un fort effet sur les cellules normales, tandis que les cellules cancéreuses étaient modérément affectées. En revanche, lorsque le traitement indirect au plasma était utilisé, l'effet sur les cellules normales était mineur, tandis que l'effet sur les cellules cancéreuses était significatif (légèrement moins efficace que le traitement direct au plasma). Notre hypothèse est que les espèces réactives à courte et moyenne durée de vie présentes uniquement lors du traitement direct au plasma endommagent la membrane cellulaire des cellules normales, permettant aux espèces réactives à longue durée de vie de pénétrer dans les cellules. Pour étayer cette hypothèse et mieux comprendre l'interaction de la membrane cellulaire avec ces espèces réactives, l'effet du traitement au plasma sur les protéines de l'albumine de sérum bovin et différents types de phospholipides (DLPC, DHAPC et DOPC) a été étudié. Comme pour les cellules normales, les protéines étaient également significativement endommagées lors de l'application d'un traitement direct au plasma, tandis que l'effet du traitement indirect au plasma était mineur. Par la suite, nous avons étudié les capacités potentielles de l'application combinée du traitement indirect au plasma et des champs électriques pulsés microsecondes (µsPEF), pour surpasser l'électroperméabilisation cellulaire in vitro, la base de l'électrochimiothérapie (ECT). Nous avons montré que le traitement combiné ouvre la possibilité de réduire l'amplitude des impulsions électriques utilisées en ECT, permettant un traitement ECT avec des effets secondaires réduits. Enfin, l'application in vivo du pPBS sur des souris femelles consanguines immunocompétentes C57Bl/6J a également été étudiée. Il est démontré que la combinaison du traitement indirect au plasma et des µsPEF retarde la croissance tumorale des souris par rapport aux traitements µsPEF ou ECT seuls.

Abstract

In this work, three different cold atmospheric-pressure plasma reactors were studied as sources of reactive oxygen and nitrogen species for biomedical applications. More specifically, the reactors used were a single-plasma jet, a multi-plasma jet and a micro-cathode sustained discharge. This work is divided in three parts. The first part contains the study of the gaseous phase of the plasmas and its main purpose is to provide information on the physical and chemical properties of the produced plasmas. Firstly, the localized electric field in the front of the ionization wave was measured by optical emission spectroscopy, based on the polarization-dependent Stark splitting and shifting of different He lines and their forbidden components. Secondly, to determine the electron density, Stark broadening of different hydrogen lines was used. Finally, the gas temperature of the plasma was estimated using the rotational distributions of appropriately selected probe molecules (OH and N2 at 309 and 316 nm, respectively). We found that the electric field in the front of the ionization wave increases when the plasma approaches the treated liquid. As a result, the gas temperature as well as the electron density of the plasma are also larger closer to the liquid. The second part of this work is a study of the chemical composition of plasma-treated PBS (pPBS). Thus, the production of H2O2, NO2–, NO3–, •OH, O2(a1Δg), O3, HCl– and ONOO– was investigated in the pPBS by performing liquid phase colorimetry coupled with absorption and fluorescence spectroscopy. Alongside, the pH and conductivity of the pPBS were also measured. On top of that, the ability to conserve the long-lived reactive species (H2O2, NO2– and NO3–) over a long period was investigated as a function of the time and temperature of storage of the pPBS. It is shown in this work that if the pPBS is stored at pertinent conditions, the concentration of these long-lived reactive species, and, thus, the anti-cancer capacity of the pPBS remains stable for more than 75 days. Knowing that these long-lived reactive oxygen and nitrogen species are the main drivers of the anti-cancer capacity of plasma treatment in oncology, the third part of this work, performed in close collaboration with biologists, was the plasma application on biological targets and the assessment of these reactive species’ contribution to its cytotoxicity. Thus, the anti-tumor capacity of direct and indirect plasma treatments, using two models of head & neck cancer cells (CAL27 and FaDu) and three normal cell lines (primary human fibroblasts, primary gingival keratinocytes, and epithelial cells), was assessed in terms of metabolic cell activity, cell viability, lipid peroxidation, intracellular ROS production and caspase 3/7 induction. We found that the selectivity of plasma treatment towards killing cancer cells instead of normal cells is highly dependent on the short-, intermediate- and long-lived reactive species that are present in the pPBS. More specifically, when the cells are treated directly with the plasma, we observed a strong effect on the normal cells, while the cancer cells were moderately affected. On the other hand, when indirect plasma treatment was used, the effect on the normal cells was minor, while the effect on the cancer cells was significant (slightly less efficient than direct plasma treatment). Our hypothesis is that short- and intermediate-lived reactive species that are present only during the direct plasma treatment damage the cellular membrane of the normal cells allowing the long-lived reactive species to penetrate into the cells. To support this hypothesis and to better understand the interaction of the cellular membrane with these reactive species, the effect of the plasma treatment on bovine serum albumin proteins and different types of phospholipids (DLPC, DHAPC and DOPC) was investigated. As for the normal cells, the proteins were also significantly damaged when direct plasma treatment was applied, while the effect of indirect plasma treatment was minor. Followingly, we investigated the potential capabilities of the combined application of indirect plasma treatment and microsecond pulsed electric fields (µsPEFs) to outperform in vitro cell electropermeabilisation, the basis of electrochemotherapy (ECT). We showed that the combined treatment opens the possibility to reduce the amplitude of the electric pulses used in ECT, allowing an ECT treatment with reduced side-effects. Finally, the in vivo application of the pPBS on inbred female immunocompetent C57Bl/6J mice was also studied. It is shown that the combination of indirect plasma treatment and µsPEFs delays the tumour growth of the mice compared to µsPEFs or ECT treatments alone.